Conoscenze  di Genetica, Biochimica e Biologia Molecolare

I contenuti dell’insegnamento sono finalizzati all’approfondimento delle basi metodologiche e scientifiche delle Tecnologie Ricombinanti e delle loro applicazioni nei diversi campi della biologia; un’attenzione particolare è rivolta alle singole reazioni che portano alla costruzione di una molecola di DNA ricombinante, al percorso scientifico che è alla  base e alle considerazioni che determinano la scelta di metodiche diverse per risolvere problemi differenti.

Conoscenze e comprensione

Lo studente dovrà acquisire conoscenze avanzate dei principi teorici e delle metodologie alla base delle tecnologie del DNA ricombinante. In particolare, lo studente dovrà conoscere le strategie di clonaggio genico, i principali vettori di clonaggio ed espressione, le tecniche di manipolazione e amplificazione degli acidi nucleici, i metodi di sequenziamento e di mutagenesi, le tecnologie di editing genomico e i sistemi per la produzione di proteine ricombinanti. Comprenderà inoltre le applicazioni delle tecnologie ricombinanti nei settori della ricerca biomedica, delle biotecnologie vegetali e animali e della produzione di biomolecole di interesse terapeutico

Capacità di applicare conoscenze e comprensione.

Lo studente sarà in grado di selezionare e applicare le più appropriate strategie sperimentali per il clonaggio e la manipolazione del DNA, la progettazione di vettori di espressione, l'editing genomico e la produzione di proteine ricombinanti. Saprà interpretare i risultati ottenuti mediante tecniche di PCR, sequenziamento, analisi dei cloni ricombinanti ed espressione genica, individuando le metodologie più idonee in funzione degli obiettivi sperimentali.

Autonomia di giudizio

Lo studente svilupperà la capacità di analizzare in maniera critica protocolli e strategie sperimentali nell’ambito delle tecnologie ricombinanti. Inoltre, lo studente sarà in grado di valutare criticamente vantaggi, limiti e potenzialità delle diverse metodologie, scegliendo gli approcci più appropriati in relazione a specifici problemi sperimentali. Sarà inoltre in grado di discutere gli aspetti scientifici, tecnici ed etici connessi all'impiego delle tecnologie di editing genomico e degli organismi geneticamente modificati.

Abilità comunicative

Lo studente sarà in grado di utilizzare la terminologia scientifica appropriata per descrivere e discutere metodologie, risultati sperimentali e applicazioni delle tecnologie ricombinanti. Saprà presentare e argomentare dati scientifici, interpretare la letteratura specialistica e comunicare efficacemente, sia in forma scritta sia orale, con interlocutori specialisti e non specialisti.

Capacità di apprendimento

Lo studente avrà sviluppato le competenze necessarie per approfondire in autonomia le continue innovazioni nel campo delle tecnologie ricombinanti attraverso la consultazione critica della letteratura scientifica e di altre fonti qualificate.

Lezioni frontali che prevedono l’uso di presentazioni in Power Point. L’insegnamento prevede un credito di esercitazioni pratiche da svolgere presso i laboratori didattici.

Il conseguimento dei crediti attribuiti all’insegnamento è ottenuto mediante una prova orale, in cui si valutano i risultati di apprendimento complessivamente acquisiti dallo studente.

La votazione finale è espressa in trentesimi, con eventuale lode. Nell’attribuzione del punteggio finale si terrà conto:

- del livello di conoscenze teorico/pratiche acquisite (50%)

- della capacità di applicare le conoscenze teorico/pratiche acquisite (30%)

- dell’autonomia di giudizio (10%)

- delle abilità comunicative (10%)

• Clonaggio genico: principi, strumenti e tecniche del clonaggio del DNA; strategie di clonaggio classiche e tecniche di assemblaggio di frammenti di DNA (Gibson Assembly, Golden Gate, Gateway Cloning e metodi affini).
• Vettori di clonaggio ed espressione per cellule procariotiche ed eucariotiche: caratteristiche strutturali e funzionali
• Manipolazione del DNA purificato: enzimi per la manipolazione del DNA (nucleasi, polimerasi, ligasi, topoisomerasi, enzimi per la modificazione delle estremità delle molecole di DNA).
• Introduzione del DNA nelle cellule viventi: colture di cellule procariotiche ed eucariotiche; trasformazione batterica; trasferimento di DNA in lieviti, cellule vegetali e cellule animali.
• Metodi di identificazione dei cloni ricombinanti: selezione e analisi dei ricombinanti.
• Reazione a catena della polimerasi (PCR): analisi e clonaggio dei prodotti di PCR. Varianti della PCR: PCR quantitativa (qPCR) e PCR digitale (dPCR).
• Analisi della sequenza nucleotidica: principi del sequenziamento secondo Sanger e tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS).
• Mutagenesi in vitro e mutagenesi sito-specifica: applicazioni nello studio della funzione genica e dell'ingegneria delle proteine.
• Tecnologie di editing genomico mediante nucleasi programmabili: ZFN, TALEN e sistemi CRISPR/Cas; base editing, prime editing e applicazioni nella ricerca biomedica.
• Produzione di proteine ricombinanti in sistemi eterologhi: sistemi procariotici ed eucariotici;  ottimizzazione dell'espressione, purificazione mediante tag di affinità e caratterizzazione delle proteine ricombinanti.
• Produzione di biomolecole ricombinanti per applicazioni biomediche e farmaceutiche: insulina, ormone della crescita, fattori della coagulazione, anticorpi monoclonali, vaccini ricombinanti, enzimi terapeutici e altre proteine di interesse clinico.
• Tecnologie di trasferimento genico e terapia genica.
• Manipolazione genetica delle piante: trasferimento genico mediato da Agrobacterium tumefaciens e metodi diretti; addizione e inattivazione genica, RNA interference ed editing genomico nelle piante.
• Produzione di animali transgenici e modelli animali geneticamente modificati: strategie di generazione, applicazioni nella ricerca di base, nello studio delle malattie e nelle biotecnologie.

T.A. Brown - Biotecnologie molecolari-Principi e tecniche; III edizione 2022-Zanichelli

D.S.T. Nicholl - Ingegneria Genetica - Zanichelli